آزمایش شمارش رتیکولوسیت

رتیکولوسیت ها گلبولهای قرمز نابالغ حاوی باقیمانده های اسید ریبونوکلئیک ریبوزومی هستند که به تازگی از مغز استخوان آزاد شده اند . ویژگی ریبوزوم ها ، ایجاد واکنش با رنگهای قلیائی خاص مثل آزور B ، بریلیانت کرزیل بلو یا نیو متیلن بلو (NMB) و تشکیل رسوبی بصورت گرانول یا فیلامانت آبی یا بنفش می باشد . این واکنش فقط با رنگهای حیاتی و در نمونه های فیکس نشده صورت می گیرد. به علت زنده بودن سلول ها هنگام رنگ آمیزی، به این نوع رنگ آمیزی، رنگ آمیزی حیاتی اطلاق می گردد.
مراحل مختلف بلوغ رتیکولوسیت ها با توجه به مشخصات مرفولوژیکی، قابل شناسایی می باشند. نابالغ ترین رتیکولوسیت ها حاوی بیشترین مقدار مواد رسوبی ، و بالغ ترین آنها فقط دارای چند جز یا رشته کوتاه از این مواد می باشند. بر این اساس ، رتیکولوسیت ها به چهار گروه تقسیم می شوندکه گروه۱ دارای کلامپ رتیکولوم و گروه ۴ حاوی چند گرانول کوچک می باشند. گروه ۲ و۳ نیز از لحاظ مرفولوژی بین این دو گروه قرار می گیرند. چون اکثر رتیکولوسیت هایی که در خون محیطی دیده می شوند از گروه۴ هستند، شناسایی دقیق رتیکولوسیتها اثر قابل توجهی بر روی صحت شمارش این سلولها دارد . بنابراین گلبولی می بایست به عنوان رتیکولوسیت شمارش گردد که دارای هسته نبوده و داخل آن دو یا چند قطعه از رسوب آبی رنگ ، که همان RNA ریبوزومی است، دیده شود.
رتیکولوسیتها در رنگ آمیزی معمولی (با رنگ های گروه رومانوفسکی)، بدلیل ترکیب بازوفیلی سیتوپلاسم و اسیدوفیل هموگلوبین حالت بازوفیل منتشری پیدا کرده و به بصورت “پلی کروماتیک” مشاهده می گردند . این پدیده بطور معمول در رتیکولوسیتهای نابالغ که دارای بیشترین میزان RNA هستند،دیده می شود .

علت انجام این آزمایش چیست؟

این آزمایش به دلایل زیر انجام می شود:

• بررسی اینکه کم خونی به دلیل کاهش تولید گلبول های قرمز ایجاد می شود و یا از دست دادن گلبول های قرمز.
• ارزیابی کارکرد مغز استخوان
• ارزیابی نحوه درمان کم خونی ها.

برای مثال: افزایش شمارش رتیکولوسیت ها به معنی درمان با آهن و یا سایر روش های درمان کم خونی است.

رنگ آمیزی
تهیه محلول رنگ:
رنگ توصیه شده در مراجع معتبر بین المللی نیو متیلن بلو می باشد برای تهیه محلول رنگ، می بایست ۱/۰ گرم رنگ نیومتیلن بلو ((NMB یا آزور B خالص را در ۱۰۰ میلی لیتر بافر فسفات ایزو اسموتیک با ۵ /۶ PH = حل نمود. برای ساخت بافر ذکر شده از محلولهای زیر استفاده می شود :

A: NaH2PO4 , 2H2O 23.4g/L         ۱۵۰mmol/L
B: Na2HPO4 21.3 g/L                   ۱۵۰mmol/L

در صورتیکه ۵۱ میلی لیتر از محلول A با ۳۵ میلی لیتر از محلول B مخلوط گردد ، PH بافر حاصل ، ۵/۶ خواهد بود .
رنگ را میتوان در ۱۰۰ میلی لیتر سیترات سالین نیز حل کرد که برای تهیه سیترات سالین ، یک حجم سیترات سدیم ۳۰ گرم در لیتر با ۴ حجم کلرید سدیم ۹ گرم در لیتر مخلوط می شود.
محلول رنگ را می بایست درون شیشه ای قهوه ای رنگ ریخته و در مدت ۲۴ ساعت به دفعات تکان داد .این محلول در دمای ۲-۶ درجه سانتیگراد قابل نگهداری می باشد . در این دما ، نیمه عمر رنگ حدود یک ماه است . هر بار قبل از استفاده، باید حجم مورد نیاز از رنگ را به منظور خارج نمودن هر گونه ذره اضافی یا رسوب ، با کاغذ صافی فیلتر نمود.
روش رنگ آمیزی:
برای رنگ آمیزی باید دو یا سه قطره رنگ NMB را با پیپت پاستور داخل لوله شیشه ای یا پلاستیکی به ابعاد ۱۰×۷۵ میلی متر ریخته و به همین حجم ، خون حاوی ضد انعقاد EDTA به آن اضافه کرده و پس از مخلوط کردن به مدت ۱۵ تا ۲۰ دقیقه در دمای ۳۷ درجه نگهداری نمود . قبل از تهیه گسترش می بایست لوله را به آرامی تکان داد تا گلبولهای قرمز مجددا به حالت سوسپانسیون درآیند. گسترش ها پس از تهیه و خشک شدن، بدون فیکساسیون و انجام رنگ آمیزی دیگری،توسط میکروسکوپ قابل بررسی می باشند .
حجم دقیق خونی که به محلول رنگ اضافه می شود بستگی به تعداد گلبولهای قرمز دارد . در موارد آنمی، مقدار خون بیشتر و در پلی سیتمی، مقدار خون کمتری ، نسبت به حالت طبیعی ، می بایست با رنگ مخلوط شود .
در یک گسترش مناسب ، ریبوزوم رتیکولوسیت ها به رنگ آبی در آمده و سلولهای بالغ در سطح لام به شکل سایه های کمرنگ آبی مایل به سبز دیده می شوند .
رنگ آمیزی و شمارش رتیکولوسیت خون در شرایطی که نمونه بعد از نمونه گیری در دمای ۶-۲ درجه نگهداری شود تا ۲۴ ساعت امکانپذیر می باشد . با گذشت ۸-۶ ساعت از زمان نمونه گیری و ماندن خون در حرارت آزمایشگاه ، رتیکولوسیت ها به تدریج بالغ شده و به گلبول قرمز بالغ تغییر می یابند که این امر بطور کاذب موجب کاهش درصد رتیکولوسیت ها می گردد. بنابراین توصیه می شود شمارش رتیکولوسیت بلافاصله بعد از جمع آوری نمونه انجام شود.

نحوه شمارش و گزارش درصد رتیکولوسیت

برای شمارش و تعیین درصد رتیکولوسیت ، گسترش نباید خیلی نازک تهیه شده باشد و محلی از گسترش جهت شمارش انتخاب شود که سلولها به خوبی رنگ شده و روی هم نیز قرار نگرفته باشند . برای تعیین درصد رتیکولوسیت ها از عدسی شیئ روغنی و در صورت امکان از عدسی های چشمی دارای دیافراگم قابل تنظیم استفاده میشود. تعداد گلبولهای قرمزی که باید مورد ارزیابی قرارگیرند رابطه معکوس با تعداد رتیکولوسیت ها دارد. بنابراین به منظور افزایش دقت در شمارش ، هرچه تعداد رتیکولوسیت ها کمتر باشد می بایست تعداد گلبولهای قرمز بیشتری مورد بررسی قرارگیرند و بالعکس.

میزان طبیعی رتیکولوسیت

میزان شمارش رتیکولوسیت ها به عنوان درصدی از گلبول های قرمز است (که تعداد رتیکولوسیت ها تقسیم بر تعداد کل گلبول های قرمز، ضرب در ۱۰۰)

میزان طبیعی رتیکولوسیت ها در جدول زیر ذکر شده است که مقادیر مرجع نامیده می شود و فقط برای راهنمایی است. این مقادیر از یک آزمایشگاه با آزمایشگاه دیگر متفاوت است٬ و آزمایشگاهی که شما مراجعه می کنید ممکن است میزان مقادیر نرمال آن با مقادیر این جدول متفاوت باشد. جواب آزمایش باید میزان نرمالی را که  آن آزمایشگاه استفاده می کند، داشته باشد. همچنین ٬ پزشک نتایج را بر اساس سلامتی و یا عوامل دیگر ارزیابی می کند. این به این معنا است که اگر جواب آزمایش خارج از میزان نرمال بود، ممکن است برای شما یا برای آن آزمایشگاه این میزان نرمال باشد.

افزایش میزان رتیکولوسیت ها

 افزایش میزان رتیکولوسیت ها ممکن است به معنی افزایش ساخت گلبول های قرمز در مغز استخوان باشد. این مسئله در خونریزی شدید، بعضی از کم خونی ها و رفتن به ارتفاعات ایجاد می شود.

این شرایط باعث از بین رفتن گلبول های قرمز می شود. ( همولیز)

میزان رتیکولوسیت ها بعد از درمان کم خونی پرنیشیوز، فقر آهن و یا کم خونی ناشی از کمبود اسید فولیک افزایش می یابد.

کاهش میزان رتیکولوسیت ها

 کاهش میزان رتیکولوسیت ها ممکن است به دلیل ساخت کمتر گلبول های قرمز در مغز استخوان باشد که ممکن است به دلیل کم خونی آپلاستیک و یا سایر انواع کم خونی ها مثل کم خونی فقر آهن باشد.

کاهش میزان رتیکولوسیت ها می تواند به دلیل عفونت، تماس با اشعه به مدت طولانی و یا توسط بعضی از داروها که باعث آسیب به مغز استخوان می شود، باشد.

چه عواملی بر  روی نتیجه آزمایش تاثیر دارد؟

عللی که شما ممکن است نتوانید این آزمایش را انجام دهید واین که نتایج آزمایش ممکن است مفید نباشد، عبارتند از:

• مصرف بعضی از داروها. مثل داروهای بیماری پارکینسون، آرتریت روماتوئید، تب، مالاریا و شیمی درمانی.
• رادیو تراپی
• باردار بودن
• تزریق خون اخیر