اسپکتروفتومتر (روش کار، آشنایی و کنترل کیفی)

اسپکتروفتومتری،اکثر آزمایش‌هایی که در آزمایشگاه شیمی بالینی انجام می‌شوند برمبنای اندازه‌گیری میزان نور جذب‌شده توسط ترکیب موردنظر می‌باشد. این میزان به‌وسیله دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری می‌شود. معمولاً اندازه‌گیری‌ها در طیف نور مرئی (Visible Range) صورت می‌گیرد. با استفاده از قانون Beer که غلظت یک ترکیب مستقیماً بستگی به میزان نور جذب‌شده یا به‌طور معکوس بستگی به نور بازتاب (Transmittance) دارد، غلظت این مواد را می‌توان محاسبه نمود.

قسمت‌های مختلف اسپکتروفتومتر معمولی را شرح خواهیم داد.

منبع نوری

برحسب تابش نور با طول‌موج مناسب به درون محلول موردنظر، منبع نوری انتخاب می‌گردد. لامپ تنگستن منبع قابل‌ استفاده‌ای برای تهیه طیف کامل نور می‌شود، البته لامپ تنگستن هالوژنه (Tungsten iodide) هم برای نور مرئی و هم UV به کار می‌رود. از لامپ هیدروژنی و دیوتریوم برای اندازه‌گیری در طیف ماوراء بنفش استفاده می‌کنند. در انتخاب اسپکتروفتومتر باید توجه نمود که در چه آزمایش‌ هایی کاربرد دارد، به‌ طور مثال لامپ هیدروژنی برای آزمایش‌ هایی که طول‌ موج لازم برای آن‌ ها بالای ۳۴۰nm باشد ضعیف و غیرقابل استفاده است.

شیار ورودی (Entrance Slit)

کار آن متمرکز کردن شعاع‌ های نوری جدا شده از ورود نور پراکنده (Stray light) به درون سیستم منوکروماتور است.

منوکروماتور (Mono chromator)

سیستمی که نور با طول‌ موج مشخص را جدا و انتخاب می‌کند. مونوکروماتور وسیله‌ ای است که طیف طول‌ موج نور را با استفاده از منشور یا Grating جدا می‌کند (در فتومترها معمولاً از فیلتر تداخلی استفاده می‌ شود).

منشور

یک شیشه با لبه‌ های تیز و به شکل هرم می‌ باشد که به علت تفاوت در ضریب شکست بر اساس طول‌ موج نور، نور سفید وارد شده به درجات مختلف پخش می‌ شود. بر اساس طول‌ موج نور، نور قرمز کمتر از ناحیه آبی یا بنفش طیف شکسته می‌شود. هر چه طول‌ موج کمتر باشد شکست آن بیشتر است.

شبکه یا Grating

وسیله‌ای است به‌ صورت یک صفحه که دارای ۳۰۰۰ یا بیشتر شیار کوچک می‌ باشد. هر شیار مانند یک منشور عمل می‌ کند و یک طیف رنگی ایجاد می‌کند. طیف‌ های هم‌ فاز یکدیگر را تقویت می‌ کنند و شدت نور بیشتری دارند.

محدوده طول‌ موج Spectra band width) SBW)

به غیر از نور لیزر، بقیه نورها به‌ صورت واقعی مونوکروم نیستند؛ یعنی فقط یک طول‌ موج نبوده و متشکل از طیفی از طول‌ موج‌ ها می‌ باشند.

میزان مونوکروماتیک بودن را با اصطلاحات زیر تعریف می‌کنند:

Spectral Band Width)  SBW): عبارتست از طیفی از طول‌ موج که از شیار خروجی سیستم Wavelength Selector می‌گذرد.

طول‌ موج اسمی (Nominal)

این شعاع نور، طول‌ موجی است که در آن ماکزیمم شدت نور وجود دارد و طول‌ موج اسمی در مرکز کل طیف خارج‌ شده قرار می‌گیرد.

برای فیلتر فتومتر، طول‌ موج اسمی، طول‌ موج ذکرشده بر روی فیلتر است و برای اسپکتروفتومتر طول‌ موج اسمی، طول‌ موجی است که بر روی دستگاه انتخاب می‌شود، مثلاً در اسپکتروفتومتر با  SBW 20 نانومتر در صــــورت انتخاب طول‌ موج ۵۴۰nm طیف نوری تولید شده بین ۵۵۰-۵۳۰ نانومتر خواهد بود، ولی ماکزیمم شدت تابش در طول‌ موج ۵۴۰ می‌ باشد. SBW نشانه مرغوبیت یک مونوکروماتور است، مثلاً Grating از نوع مرغوب دارای SBW برابر با ۵ نانومتر می‌باشد. هر چه SBW یک مونوکروماتور کمتر باشد، شدت نور ایجاد شده و تعداد جذب نوری بیشتر است. برای جذب نوری در طول‌ موج خاص به میزان ۰٫۹۹% باید SBW کمتر از ۱۰nm باشد.

هر ماده شیمیایی دارای طیف جذب نوری خاصی است. برای اندازه‌ گیری هر ماده شیمیایی باید از اسپکتروفتومتری استفاده کرد که SBW آن ۱/۰طیف جذبی ماده مورد نظر (NBW=Natural Band Width ) باشد.

شیار خارجی (Exit Slit)

کار آن متمرکز کردن شعاع‌ های نوری جدا شده بر روی کووت است.

کووت

وظیفه کووت نگه داشتن محلول در دستگاه است تا جذب نوری آن اندازه‌ گیری شود. کووت‌ ها از جنس Soft glass، بروسلیکات، کوارتز و پلاستیک می‌ باشند. کووت‌ های شیشه‌ای مخصوص برای طول‌ موج ۹۵۰nm- 320 مناسب هستند. از کووت کوارتز برای طول‌ موج کمتر از ۳۲۰nm استفاده می‌شود. کووت‌ ها در سطوح مقطع دایره‌ای و مربع موجود می‌ باشند. کووت‌ های مربع از جذب بیشتری برخوردارند.

دتکتور

کار آن تبدیل انرژی نوری به الکتریکی است.

عقربه کالوانومتر

کار آن نشان دادن مقدار جذب یا عبور نور است.

توصیه‌های کلی

1. همیشه نیم ساعت قبل از خواندن تست‌ها، اسپکتروفتومتر را روشن کنید.
2. از یک پایدار کننده ولتاژ در مسیر برق و اسپکتروفتومتر استفاده کنید. منظور همان دستگاه UPS می باشد.
3. اسپکتروفتومتر را از جای خود حرکت ندهید. به آن ضربه وارد نشود.
4. در موقع عدم استفاده از اسپکتروفتومتر، حتماً روکش آن را بکشید.
5. نظافت و تمیز کردن اسپکتروفتومتر الزامی است:

سالی دو بار بدنه‌ ی اسپکتروفتومتر را باز کرده و گرد و غبار موجود را تمیز نمایید.

روغن‌ کاری چرخ‌ دنده‌ ها در فواصل سه‌ ماهه ضروری است.

لامپ اسپکتروفتومتر را با Lens paper ماهی یک بار تمیز نمایید (ولی باید توجه داشته باشید که به هیچ وجه دست شما با لامپ تماس پیدا نکرده باشد چون طول موج اشتباه تولید خواهد کرد.)

مسیر کووت‌ ها و شیارها را در فواصل هفتگی تمیز نمایید.

1. حداقل خطای نسبی T% در ۳۶٫۸% و  جذب (Absorbance) در۰٫۴۳۹ می‌باشد. در صورتی‌ که جذب نوری محلول بیشتر از ۰٫۷ باشد یا T کمتر از ۲۰%، محلول مورد نظر را رقیق کنید تا جذب نوری در محدوده۰٫۱-۰٫۷  قرار گیرد.
2. در صورتی‌ که جذب محلول کمتر از ۰٫۱ یا T بیشتر از ۸۰% باشد، خطای زیادی حاصل می‌شود، لذا توصیه می‌شود حجم نمونه را برحسب نیاز ۲ تا ۳ برابر بردارید تا جذب در محدوده (۰٫۱-۰٫۷) قرار گیرد و ضریب مربوطه را در محاسبه دخالت دهید. بهترین محدوده برای خواندن جذب OD= 0.1-0.7  و برای T 20-10% می‌ باشد.
3. حجم محلول در کووت باید بالاتر از قسمتی باشد که نور از آن عبور می‌کند. اگر حجم محلول نهایی کم است، مقدار نمونه و راژنت را دو برابر کنید.
4. شستشوی متناوب کووت با محلول‌ های سود، پتاس و اسید کلریدریک رقیق، وایتکس( ۱ به ۱۰ رقیق شده ) اسید سولفوکرومیک و غیره توصیه می‌شود.
5. کووت را به همراه سایر لوله‌ ها نشویید چون ممکن است خش‌ دار شوند.
6. هرگز کووت را با دست لمس نکنید.
7. کووت باید به‌ آرامی در محل خاص خود قرار گیرد و محلول درون آن فاقد حباب باشد. ضمناً باید در خوانش طولانی درب کووت بسته شود تا تبخیر صورت نگیرد.
8. اسپکتروفتومتر پس از تحویل، مطابق دستور کار بروشور و توسط کارشناس مربوطه، نصب و راه‌ انداری شود. به نظافت و کنترل کیفی دستگاه توجه کنید. لیست اقدامات انجام شده ضبط و نگهداری شوند.

کنترل کیفی اسپکتروفتومتر

تست‌ های زیادی جهت کنترل کیفی اسپکتروفتومتر وجود دارد که شامل موارد زیر می‌باشد

صحت طول‌ موج، خطی بودن، صحت فتومتریک، کنترل تعویض لامپ، رانش فتومتری، کدورت محلول‌ها، طیف ناخواسته، یکسانی کووت‌ها و کنترل SBW

برای اطمینان از صحت طول‌ موج جداشده روش‌های زیر متداول است

راه چشمی

هر طول‌ موج نور دارای رنگ خاصی است. برای کنترل، طول‌ موج اسپکتروفتومتر را بر روی طول‌ موج مورد نظر تنظیم کرده و رنگ نور را با قرار دادن یک مقوای سفید در جلو شیار خارجی مشاهده می‌کنیم، مثلاً در ۵۸۵ نانومتر رنگ باید زرد باشد. صحت کالیبراسیون طول‌ موج در آزمایشگاه‌ های آنزیمی اهمیت زیادی دارد.

جایگزینی منبع نوری

صحیح‌ ترین راه بررسی صحت طول‌ موج، جایگزینی منبع نوری معمولی اسپکتروفتومتر با منبع نوری دیگری است که دارای ماکزیمم تابش نوری در طول‌ موج مشخص ‌باشد، مثلاً لامپ دوتریرم دارای خطوط تابشی ناپیوسته در طول‌موج ۴۸۶nm و ۶۵۶nm است.

استفاده از فیلترهای شیشه‌ ای نظیر Holmium oxide و Didymium

این فیلترها دارای پیک‌ های جذبی مشخصی در طول‌ موج‌ های خاصی می‌ باشند. فیلتر دیدیمیوم در ۵۳۰ و ۵۸۵nm حداقل T% را دارد.

روش کار به این صورت است که

دستگاه را روشن می‌ کنیم و طول‌ موج را روی ۵۳۰ تنظیم می‌کنیم. فیلتر دیدیمیوم را در محفظه کووت قرار می‌دهیم. T را بین ۶۰-۵۰% تنظیم می‌ کنیم. طول‌ موج را روی ۵۲۰ تنظیم می‌ کنیم و به‌ آرامی طول‌ موج را به سمت ۵۴۰nm زیاد می‌کنیم. هر کجا کمترین درصد T را مشاهده کردیم، طول‌ موج را یادداشت می‌کنیم. حداقل T باید در محدوده ۱±۵۳۰ به دست آید، اگر این‌ طور نشد باید طول‌ موج تنظیم شود، به‌ این‌ ترتیب که پیچ تنظیم طول‌ موج، اگر ۱nm کمتر باشد (۵۲۹nm) برخلاف جهت حرکت عقربه‌ های ساعت به تعداد ۸ کلیک می‌چرخانیم. برای هر ,nm8 کلیک می‌ چرخانیم و از فیلتر Holmium oxide برای اسپکتروفتومترهای با SBW کمتر از nm8 استفاده می‌کنیم.

محلول رنگی

محلول دی کرومات پتاسیم (۵۰ میلی گرم دی کرومات پتاسیم در یک لیتر اسید سولفوریک ۰۱/۰ نرمال حل گردیده) باید دارای ماکزیمم جذب نوری در ۲۵۷ و ۳۵۰ نانومتر باشد.

محلول پارانیتروفنل (۰٫۰۴mmol/litدر سود ۰٫۰۱نرمال) باید دارای ماکزیمم جذب نوری در ۴۰۱ نانومتر باشد.

محلول سولفات آمونیوم کبالت (۰٫۰۷۳۵mmol/litدراسید سولفوریک۰٫۱۸M) باید دارای ماکزیمم جذب نوری در ۵۱۲ نانومتر باشد.

محلول سیان‌ مت هموگلوبین (۲۰ میکرولیتر خون و ۵ میلی لیتر درابکین ) . میزان جذب نوری این محلول را در طول‌ موج‌های متفاوت اندازه می‌گیریم. از ‌۴۹۰ نانومتر شروع کرده و هر ۵ نانومتر (با بلانک درابکین) می‌خوانیم. باید ماکزیمم جذب نوری در ۵۴۰ نانومتر باشد.

کنترل طول‌ موج اسپکتروفتومتر باید در فواصل هفتگی و پس از هر تغییر یا تعمیر دستگاه صورت پذیرد.

خطی بودن (Linearity)

عبارتست از قدرت اسپکتروفتومتر برای ثبت یک سیگنال به‌ صورت متناسب با مقدار نور

خطی بودن به روش‌های زیر مورد آزمایش قرار می‌گیرد

محلول رنگی شامل

پارانیترو فنل در ۴۰۵ نانومتر

سولفات آمونیوم کبالت در ۵۱۲ نانومتر

سولفات مس در ۶۵۰ نانومتر

سیان‌مت هموگلوبین در ۵۴۰ نانومتر

محلول دی کرومات پتاسیم

بررسی خطی بودن با استفاده از محلول در طول موجهای مختلف

برای بررسی خطی بودن در طول موج ۵۴۰ نانومتر از محلول HiCN ، در طول موج ۴۰۵ نانومتر از محلول پارانیتروفنل ۰۸/۰ میلی مول در لیتر و در طول موج ۳۴۰ نانومتر از محلول دی‌کرومات پتاسیم استفاده می گردد.

جهت بررسی خطی بودن طول موج ۵۴۰ نانومتر ، می بایست با مخلوط نمودن خون با درابکین ، ذخیره ای (Stock) از محلول سیان مت هموگلوبین با جذب نوری حدود ۲ تهیه شود .( بطور مثال از اضافه کردن ۱۰۰ میکرولیتر خون با هموگلوبینg/l 170 به ۵۵ میلی لیتر درابکین ، محلولی با جذب نوری حدود ۰۹/۲ بدست می آید .) اگر میزان هموگلوبین نمونه کم باشدحجم بیشتری از خون ، می بایست به درابکین اضافه شود. سپس از این محلول ذخیره ، حداقل ۴ رقت تهیه می شود (بطور مثال ۲/۱ ، ۴/۱،  ۸/۱ و۱۶/۱) و جذب نوری محلول ذخیره و رقتهای تهیه شده‌در طول موج یاد شده در مقابل بلانک درابکین، قرائت می‌گردد تا ۵ خوانده بدست آید. جذبهای نوری قرائت شده به عنوان مقدار مشاهده شده (Observed) در نظر گرفته می‌شود .

برای محاسبه میزان خطا در هر رقت ،جذب نوری(OD) رقتی از محلول که در حدود ۴/۰ باشد به عنوان مبنا انتخاب و میزان خطای سایر رقتها با توجه به آن محاسبه می شود تا جذب مورد انتظار بدست بیاید .

بطور مثال اگر جذب نوری نمونه با رقت ۴/۱ ، حدود ۴/۰ باشد .جذب نوری مورد انتظار برای رقت ۲/۱ بصورت زیر محاسبه می شود

 

جذب نوری	رقت
۴/۰	۴/۱
x	۲/۱

 

مقدار  X بدست آمده ، مقدار مورد انتظار (Expected ) جذب نوری نمونه در رقت ۲/۱ می باشد. بدین ترتیب پس از محاسبه جذب نوری مورد انتظار برای رقتهای مختلف ، میزان عدم صحت هر رقت با استفاده از فرمول Bias تعیین می‌گردد .

مثال زیر ، میزان عدم صحت جذب نوری رقتهای مختلف نمونه سیان مت هموگلوبین در یک دستگاه فتومتررا نشان می دهد .

 

%Bias	(OD observed)جذب نوری بدست آمده	(OD expected)جذب مورد انتظار
۰٫۹۱	۲٫۰۹۴	۲٫۰۷۵
۰٫۱۸	۱٫۶۶۳	۱٫۶۶
۱٫۱۲	۱٫۲۵۹	۱٫۲۴۵
۱٫۹۷	۱٫۰۱۷	۱٫۰۳۷
۰٫۴۸	۰٫۸۲۶	۰٫۸۳
–	۰٫۴۱۵	–
۲٫۱	۰٫۲۱۲	۰٫۲۰۷

 

برای بررسی خطی بودن در طول موج ۴۰۵ نانومتر از محلول پارانیتروفنل ۰۸/۰ میلی مول در لیتر استفاده می‌گردد .

طرز تهیه این محلول:

وزن یک مول پارانیتروفنل = ۱۱/۱۳۹ گرم

یک میلی مول =۱۳۹۱۱/۰ گرم

برای تهیه پارانیتروفنل ۰۸/۰  میلی مول در لیتر ، با استفاده از محاسبه زیر ، می بایست  ۱۱۲۸۸/۱۱ پارانیتروفنل (  بطور تقریبی ۱/۱۱ میلی گرم) در یک لیتر هیدروکسید سدیم Na OH) 01/0) نرمال حل شود.

۰٫۱۳۹۱۱ × ۰٫۰۸ = ۰٫۰۱۱۱۲۸۸  = گرم ۱۱٫۱۱۲۸۸ میلی‌گرم ~ ۱۱٫۱ میلی‌گرم

این محلول جذبی در حدود ۲ خواهد داشت و با تهیه رقتهای مختلف در سود Na OH) 01/0) نرمال می‌توان خطی بودن در محدوده جذب ۰٫۱ تا ۲ را در طول موج ۴۰۵ نانومتر و در مقابل بلانک سود، بررسی نمود.بطور مثال با تهیه محلولهایی با غلظت ۰٫۰۶ ، ۰٫۰۴ ، ۰٫۰۲ ،  ۰٫۰۱ و ۰٫۰۰۵ میلی مول در لیتر نتایج زیر بدست آمده و Bias محاسبه گردیده است.

جذب نوری	غلظت
۰٫۴۶۳	۰٫۰۲
x	۰٫۰۴

 

همانطور که  قبلا گفته شد جذب نوری حدود ۰٫۴ را ملاک قرار داده و با تناسب مانند مثال زیر جذب نوری مورد انتظار هر غلظت را محاسبه نمایید.

 

Bias %	جذب نوری بدست آمده	جذب نوری مورد انتظار	غلظت محلول پارانیتروفنل  µmol/L
۳	۱٫۹۰۸	۱٫۸۵۲	۰٫۰۸
۲	۱٫۴۱۸	۱٫۳۸۹	۰٫۰۶
۱٫۲	۰٫۹۳۷	۰٫۹۲۶	۰٫۰۴
–	۰٫۴۶۳	–	۰٫۰۲
۲٫۶	۰٫۲۲۵	۰٫۲۳۱	۰٫۰۱
۲٫۶	۰٫۱۱۳	۰٫۱۱۶	۰٫۰۰۵

 

برای بررسی خطی بودن درطول موج ۳۴۰نانومتر از محلول دی‌کرومات پتاسیم استفاده می‌شود.

برای تهیه محلول، پودر دی‌کرومات پتاسیم را در oven با حرارت ۱۱۰ درجه سانتی‌گراد به مدت یکساعت خشک کرده و ۲۰۰  میلی‌گرم آن را با اسید سولفوریک ۰۱/۰ نرمال به حجم ۱ لیتر برسانید. این محلول را بعنوان ذخیره در شیشه تیره نگهداری نمائید. محلول ذخیره جذبی در حدود ۲ خواهد داشت و با تهیه رقتهای مختلف  در اسید سولفوریک ۰۱/۰ نرمال، می‌توان خطی بودن در محدوده جذب ۰٫۱ تا ۲ را در مقابل بلانک اسید سولفوریک، درطول موج ۳۴۰ نانومتر بررسی نمود. بطور مثال با تهیه محلولهایی با غلظت ۲۰۰ ، ۱۵۰ ، ۱۰۰ ،  ۵۰ ، ۲۵ و ۱۰ میلی گرم در لیتر نتایج زیر بدست آمده و Bias محاسبه گردیده است.

جذب نوری	غلظت
۰٫۴۹۳	۵۰
x	۲۵

 

مشابه مثال قبل جذب نوری حدود ۰٫۴ را ملاک قرار داده و با تناسب مانند مثال زیر جذب نوری مورد انتظار هر غلظت را محاسبه نمایید.

اسپکتروفتومتر (روش کار، آشنایی و کنترل کیفی) اسپکتروفتومتر (روش کار، آشنایی و کنترل کیفی) اسپکتروفتومتر (روش کار، آشنایی و کنترل کیفی)

Bias %	جذب نوری بدست آمده	جذب نوری مورد انتظار	غلظت محلول دی‌کرومات پتاسیم  mg/L
۱٫۸	۲٫۰۰۷	۱٫۹۷۲	۲۰۰
۰٫۵	۱٫۴۸۶	۱٫۴۷۹	۱۵۰
۰٫۵	۰٫۹۹۱	۰٫۹۸۶	۱۰۰
–	۰٫۴۹۳	–	۵۰
۰٫۸	۰٫۲۴۵	۰٫۲۴۷	۲۵
۴	۰٫۰۹۵	۰٫۰۹۹	۱۰

اسپکتروفتومتر (روش کار، آشنایی و کنترل کیفی) اسپکتروفتومتر (روش کار، آشنایی و کنترل کیفی) اسپکتروفتومتر (روش کار، آشنایی و کنترل کیفی) اسپکتروفتومتر (روش کار، آشنایی و کنترل کیفی) 

میزان عدم صحت  مجاز  در هر رقت حداکثر ۵%  پیشنهاد می‌شود . ولی بهتر است این مقدار را براساس دستورالعمل سازنده تعیین نمود.

در صورت امکان، استفاده از فیلترهای شیشه‌ای  solid glass filter  مانند دیدمیوم، جایگزینی برای روش قبل میباشد.

Didymium Filter در ۵۵۰ nm:

جذب را در طول‌موج ۵۵۰ نانومتر با هوا صفر می‌کنیم، بعداً جذب فیلتر دیدیمیوم را اندازه می‌گیریم. به همین ترتیب جذب را با هوا روی۰٫۲۵ تنظیم می‌کنیم و فیلتر دیدیمیوم را گذاشته و جذب را می‌خوانیم. سپس جذب را با هوا روی۰٫۵۰ تنظیم کرده و فیلتر دیدیمیوم را گذاشته و جذب را می‌خوانیم. درصورتی‌که اسپکتروفتومتر خطی باشد، باید تفاوت جذب‌ها در مراحل متوالی با فیلتر دیدیمیوم مساوی باشد. خطی بودن اسپکتروفتومتر باید در فواصل هفتگی و پس از هر تغییر و تعمیر دستگاه بررسی شود.

اسپکتروفتومتر (روش کار، آشنایی و کنترل کیفی) اسپکتروفتومتر (روش کار، آشنایی و کنترل کیفی) اسپکتروفتومتر (روش کار، آشنایی و کنترل کیفی) اسپکتروفتومتر (روش کار، آشنایی و کنترل کیفی) 

۰٫۷۵	۰٫۵۰	۰٫۲۵	۰	جذب در ۵۵۰ nm
۰٫۸۴۶	۰٫۵۹۶	۰٫۳۴۶	۰٫۰۹۶	جذب فیلتر دیدیمیوم

اسپکتروفتومتر (روش کار، آشنایی و کنترل کیفی) اسپکتروفتومتر (روش کار، آشنایی و کنترل کیفی) اسپکتروفتومتر (روش کار، آشنایی و کنترل کیفی) اسپکتروفتومتر (روش کار، آشنایی و کنترل کیفی)

صحت فتومتریک

هدف از صحت فتومتریک این است که آیا حداکثر جذب نوری به تعداد مشخص در طول‌موج خاصی صورت می‌گیرد یا خیر

برای این کنترل، مقدار جذب نوری محلولی با غلظت مشخص در طول‌موج خاصی تعیین می‌شود.

محلول‌های متفاوتی برای این کار مورداستفاده قرار می‌گیرند

محلول دی کرومات پتاسیم (K2Cr2O7)

حدود ۵۰ میلی گرم از دی کرومات پتاسیم را به مدت یکساعت در درجه حرارت ۱۱۰ درجه سانتی گراد قرارداده تا خوب خشک شود. سپس  با ترازوی کالیبره، دقیقاً ۵۰ میلی گرم از ماده فوق برداشته و در یک لیتر اسید سولفوریک ۰۱/۰ نرمال حل میگردد . سپس اسپکتروفوتومتر توسط بلانک اسید سولفوریک ۰۱/۰ نرمال در طول موج۳۵۰ نانومتر صفر شده و جذب نوری محلول دی کرومات پتاسیم در اسید سولفوریک قرائت می‌گردد . جذب نوری در محدوده ۰۰۵ /۰ ± ۵۳۶/۰ نشاندهنده صحت فتومتریک دستگاه می‌باشد.چون NBW محلول دی کرومات ۶۳nm است باید برای خوانش از اسپکتروفتومتری استفاده شود که SBW آن ۶nm یا کمتر باشد.

محلول سولفات آمونیوم کبالت (CoSo4[NH44] So4, 6H2O)

۱۴٫۴۸۱  گرم از این ماده در ۱۰ ml اسید سولفوریک غلیظ حل شده و با آب مقطر به حجم یک لیتر رسانده می‌شود.

جذب نوری این محلول در طول‌موج‌های مختلف عبارتست از:

اسپکتروفتومتر (روش کار، آشنایی و کنترل کیفی) اسپکتروفتومتر (روش کار، آشنایی و کنترل کیفی) اسپکتروفتومتر (روش کار، آشنایی و کنترل کیفی) اسپکتروفتومتر (روش کار، آشنایی و کنترل کیفی)

جذب نوری	طول‌موج
۰٫۰۱۲	۴۰۰ nm
۰٫۰۷۷	۴۵۰ nm
۰٫۱۶۳	۵۰۰ nm
۰٫۰۷۷	۵۵۰ nm

اسپکتروفتومتر (روش کار، آشنایی و کنترل کیفی) اسپکتروفتومتر (روش کار، آشنایی و کنترل کیفی) اسپکتروفتومتر (روش کار، آشنایی و کنترل کیفی) اسپکتروفتومتر (روش کار، آشنایی و کنترل کیفی)

توصیه می‌شود صحت فتومتریک به‌صورت ماهانه کنترل شود. اگر صحت فتومتریک کنترل شد و در محدوده قابل‌قبول بود، یعنی همه قسمت‌های اسپکتروفتومتر تنظیم است.

کنترل تعویض لامپ

 لامپ‌ها به‌صورت آرام و پیوسته در معرض فرسودگی قرار دارند، در نتیجه باید در فواصل زمانی مرتب آن‌ها را کنترل و بررسی کرد. بعد از نصب لامپ جدید باید سیستم نوری دستگاه تنظیم شود تا حداکثر میزان نور پس از عبور کووت به فتوسل برسد.

روش کنترل با استفاده از آب مقطر

1. یک کووت پر از آب مقطر در دستگاه قرار دهید و طول‌موج مناسب (۵۵۰ نانومتر) را انتخاب کنید.
2. عقربه گالوانومتر در وسط صفحه تنظیم شود.
3. لامپ و دیگر اجزاء نوری به‌ نوبت، کمی تغییر داده شوند و اثر آن‌ها بر روی T یا A بررسی شود.
4. محلی که حداکثر T به دست آید بهترین موقعیت هر یک از اجزاء سیستم نوری است.

رانش فتومتری (Drift)

یک منبع اصلی خطا در اسپکتروفتومتری، عدم پایداری کمیت اندازه‌گیری شده (A یا T) نسبت به زمان یا Drift می‌باشد. این رانش ممکن است به علت فرسودگی شدید منبع نور باشد. ازآنجاکه مقیاس جذب نور لگاریتمی است، رانش عقربه از صفر در طول زمان موجب خطا در تعیین غلظت می‌شود، بنابراین باید پس از خواندن هر ۱۰-۵ تست، رانش را کنترل کرده و دستگاه را مجدداً صفر کنید. صفر را با کووت خالی یا کووت محتوی آب مقطر یا محلول بلانک تنظیم کنید. اگر اسپکتروفتومتر به مدت طولانی روشن باشد، دستگاه گرم شده و عملکرد اولیه آن از دست می‌رود و Drift ایجاد می‌شود. درانجام تست‌هایی که از فاکتور استفاده می‌شود، اگر دستگاه Drift داشته باشد، خطای فاحشی ایجاد می‌شود. Drift، ثابت‌قدم بودن اسپکتروفتومتر را کنترل می‌کند.

روش کنترل

به ازای هر ۲۰-۱۰ خوانش، یک‌ بار بلانک را به دستگاه می‌دهیم که نباید تغییر کند و در صورت وجود Drift در فواصل کوتاه، دستگاه را صفر کنیم یا مقدار بالا یا پائین‌رفته را از عدد خوانده‌ شده تست‌ها کم یا زیاد می‌کنیم.

راه دیگر بررسی رانش فتومتری این است که ابتدا دستگاه را با درابکین صفر کرد و سپس محلول سیانومت هموگلوبین را در کووت ریخته و سر آن را با پارافیلم محکم نمود وجذب نوری این محلول هر ۵-۱۵ دقیقه بمدت یکساعت اندازه گیری نمود. حداکثر تغییر مجاز در جذب های نوری قرائت شده طی این مدت ۰٫۰۰۵± می باشد.

کدورت محلول‌ها

برای اندازه‌ گیری فتومتری، معرف‌ ها و محلول‌ های حاصل باید شفاف باشند. در صورت کدورت، واکنش باید تکرار شود. آزمایش را با رقیق کردن نمونه تکرار کنید و یا به‌ صورت Sample blank عمل کنید و جذب نوری بلانک نمونه را از سایر لوله‌ها کم کنید.

کنترل (SBW (Spectral Band Width

برای کنترل SBW اسپکتروفتومتر از روش‌های زیر استفاده می‌شود:

لامپ بخار جیوه (Mercury Vapor Lamp)

Interference Filter با SBW معادل ۱-۲ نانومتر

اگر SBW به‌ دست‌ آمده دستگاه با روش فوق با SBW ادعا شده دستگاه تفاوت داشت، هیچ کار نمی‌توان انجام داد، به جز این‌ که تست‌ های آنزیمی حساس با این دستگاه خوانده نشود.

(Cuvette matching) یکسانی کووت‌ها

میزان جذب نوری تمام کووت‌هایی که برای اندازه‌گیری و کالیبراسیون به کار می‌روند باید یکسان باشند.

روش کنترل کووت

استفاده از آب مقطر

تمام کووت‌ها را از آب مقطر پر می‌کنیم و دستگاه را با کووت اول صفر می‌کنیم و جذب کووت‌های دیگر را اندازه‌ می‌گیریم. نباید بیش از±۰٫۰۱با هم تفاوت داشته باشند.

استفاده از محلول سیان مت هموگلوبین

با محلول درابکین و طول‌موج مناسب دستگاه را صفر می‌کنیم. در کووت اولی محلول سیان‌مت هموگلوبین ریخته و در دستگاه قرار می‌دهیم و T را یادداشت می‌کنیم. همان محلول را با سایر کووت‌ها می‌خوانیم. هر کووت که بیش از  ۰٫۰۱۵با سایر کووت‌ها تفاوت داشته باشد را کنار می‌گذاریم.

طیف ناخواسته یا (Stray light)

به معنی وجود طول‌موج‌های ناخواسته در نور خارج‌شده از مونوکروماتور می‌باشد که باعث تداخل و خطا می‌شود. وجود Stray light را به‌وسیله اندازه‌گیری درصد عبور نور از درون ماده‌ای که در طول‌موج مشخصی دارای عبور نوری ۵% (جذب نوری ۱۰۰%) می‌باشد تعیین می‌کنند. میزان عبور نور در این طول‌موج به علت وجود Stray light می‌باشد. عبور نور از محلول‌های زیر در طول‌موج‌های ذکرشده برابر ۵% می‌باشد و از محلول‌های زیر برای اندازه‌گیری Stray light استفاده می‌شود.

کلرید پتاسیم KCl) 12) گرم در لیتر در طول‌موج ۲۰۰ nm- 175

استون در طول‌ موج ۲۵۰-۳۲۰ nm.

سدیم نیتریت ۵۰ گرم در لیتر در طول موج ۳۰۰-۳۸۵ نانومتر

روش کار

طول‌موج مناسب را بر روی دستگاه انتخاب کرده و دستگاه را روشن می‌کنیم، سپس دستگاه را بر روی صفر و بعد با طول‌موج روی ۱۰۰% عبور نور تنظیم می‌کنیم. طول‌موج به مقدار اولیه برگردانده می‌شود و درصد عبور نور در آن طول‌موج قرائت می‌شود. اگر T بالاتر از%۰ باشد وجود Stray light را نشان می‌دهد. اگر T بالاتر از ۲% باشد Stray light غیرقابل قبول است.

توجه

آزمایشگاههایی که از فتومتر استفاده می‌نمایند ، ازبین پارامترهای گفته شده تنها می‌توانند خطی بودن، رانش فتومتری و انوار ناخواسته را بررسی نمایند. سایر موارد ذکر شده و همچنین دمای محفظه باید از طریق شرکت پشتیبان بررسی شود.